皮肤变态反应试验

原理：

抗原物质作用于机体后可致使机体的反应性发生改变。当机体再次暴露于相同抗原时，所产生的反应与首次不同，或出现对机体有利的免疫反应，或出现对机体组织有损伤的变态反应。变态反应亦称为超敏反应（hypersensitivity）或过敏反应（anaphylaxis）。

试验目的：

确定重复接触化妆品及其原料对哺乳动物是否可引起变态反应及其程度。

实验动物通过多次皮肤涂抹（诱导接触）或皮内注射受试物 10d—14d（诱导阶段）后，给予激发剂量的受试物，观察实验动物并与对照动物比较对激发接触受试物的皮肤反应强度。试验方法包括局部封闭涂皮试验（Buehler Test, BT），豚鼠最大值试验 (Guinea Pig Maximinatim Test , GPMT)

预测模型：

致敏强度分级标准

注：致敏率为0%时，可判为未见皮肤变态反应。

*试验结果应能得出受试物的致敏能力和强度。这些结果只能在很有限的范围内外推到人类。引起豚鼠强烈反应的物质在人群中也可能引起一定程度的变态反应，而引起豚鼠较弱反应的物质在人群中也许不能引起变态反应。

体外-keratinosens

基本原理：

本方法参考OECD TG 442D <In Vitro Skin Sensitisation Assays Addressing The AOP Key Event On keratinicyte Activation，Appendix IA: In Vitro Skin Sensitisation: The ARE-Nrf2 Luciferase KeratinoSens^TM Test Method>。KeratinoSens^TM是一个基于转染了选择性质粒的HaCaT角质细胞作为检测系统的方法。通过定量检测由Keap1-Nrf2-ARE反应通路激活引起的荧光素酶基因表达情况，作为皮肤致敏的反应量化指标。

目的：该试验的目的是有助于评估化学品的皮肤致敏潜力。在角质形成细胞中诱导细胞保护途径以应对亲电性和氧化应激是解决皮肤致敏化不良结果途径的第二个关键事件(AOP)。

基本步骤：

KeratinoSens细胞接种于96孔板，维持培养24h，形成半汇合单层。然后将样品系列浓度暴露于细胞48小时后，进行荧光素酶诱导和细胞毒性测定。计算细胞活率和诱导倍数FI、EC1.5值。

预测模型：

以下情况满足四项即可认为该受试物为阳性结果，否则可考虑为阴性：

1）Imax大于1.5，并且与溶剂对照（阴性对照DMSO）比较具有统计学意义；

2）产生大于1.5倍荧光活性的最低浓度情况下，细胞活率大于70%；

3）EC1.5小于1000μM（或者相对没有相对分子质量的物质，小于200μg/mL）；

4）存在十分明显的剂量反应关系。

体外 h-calt

基本原理：

本方法参考OECD TG 442E <IN VITRO SKIN SENSITISATION ASSAYS ADDRESSING THE KEY EVENT ON ACTIVATION OF DENDRITIC CELLS ON THE ADVERSE OUTCOME PATHWAY FOR SKIN SENSITISATION>，OECD TG 442E（2018）In Vitro Skin Sensitisation Assays Addressing The Key Event On Activation Of Dendritic Cells On The Adverse Outcome Pathway For Skin Sensitisation - Annex I: In Vitro Skin Sensitisation: Human Cell LineActivation Test (H-CLAT)在暴露于受试物24小时后，定量测定人单核细胞白血病细胞系THP-1细胞表面标志物表达（即CD86和CD54）的变化。

h-CLAT方法量化了人单核细胞白血病细胞系THP-1暴露于致敏剂后，与单核细胞和树突状细胞(DC)(即CD86和CD54)激活过程相关的细胞表面标记物的表达变化。然后，测量的CD86和CD54细胞表面标记物的表达水平被用于支持皮肤致敏剂和非致敏剂之间的区分。

目的：通过细胞表面特征标志物CD54和CD86的改变可对物质潜在的致敏性进行预测。

基本步骤：

数据分析：

对于CD86/CD54 表达测量，每种测试化学品至少在两次独立运行中进行测试，以得出单一预测（阳性或阴性）。如果在2 次中的2 次或3 次独立运行中的至少2 次中至少满足以下条件之一，则h-CLAT 预测被认为是阳性的，否则h-CLAT 预测被认为是阴性的：

RFI CD86在至少一种测试浓度（细胞活力≥50%）中等于或大于150%；

RFI CD54在至少一种测试浓度（细胞活力≥50%）中等于或大于200%。