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概要:医疗器械
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实验原理

本方法参考GB/T 16886.5:2017/ISO 10993-5:2009《医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验》,通过确定在琼脂糖凝胶中扩散后的细胞毒性来评估潜在刺激性。该试验用于细胞毒性定性评价,该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的物质或与琼脂反应的物质。

目的:通过确定在琼脂糖凝胶中扩散后的细胞毒性来评估潜在刺激性。

基本步骤:

L929细胞接种至培养皿中,维持培养24h至细胞近汇合80%以上。显微镜检查培养细胞的近汇合和形态学情况。弃去培养皿中的培养基,然后将融化琼脂琼与培养基混合配制所需比例,吸取一定体积至皿中。中性红染色约1530min后弃去。然后将实验样品的平行试样小心地放在皿的固化琼脂层上。暴露24h后倒置显微镜下观察各组细胞形态及褪色情况,按下表进行评分。

评判标准:

在去除样品前后进行观察,倒置显微镜下观察并记录细胞形态变化,细胞形态异常包括一般形态变化、空泡、脱壁、溶解和膜完整性丧失。按表1进行细胞形态定性观察分级。按表2进行反应区域结果评判。

表1. 细胞毒性形态学定性分级

分级

细胞反应

细胞形态定性描述

0

细胞质内颗粒离散,未发现细胞溶解,细胞生长未抑制。

1

轻微

<20%细胞变圆和松散贴壁,细胞质内未发现颗粒物质减少或形态异常;偶有细胞溶解;仅轻微细胞生长抑制。

2

轻度

<50%细胞变圆,细胞质内颗粒物质减少,部分细胞溶解;<50%细胞生长抑制。

3

中度

<70%细胞变圆或溶解;细胞层尚未完全破坏,>50%细胞生长抑制。

4

严重

接近全部或全部细胞层破坏或细胞溶解。

 

表2. 琼脂和滤膜扩散以及或直接接触反应分级

分级

细胞反应

反应描述

0

未发现试样周围和下方未观察到反应区域

1

轻微

试样下方一些畸形或退化细胞

2

轻度

反应范围仅限于试样下方局部区域

3

中度

反应范围扩展至试样周围1.0cm内

4

重度

反应范围扩展至试样边缘>1.0cm

 

评分和判定标准按照GB/T 16886.5:2017/ISO 10993-5:2009《医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验》,如果根据表1和表2的评分>2时,认为具有细胞毒性效应。


实验原理

参考ISO 10993-5-2009(EN)《医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验》利用体外细胞毒性试验-吉姆萨染色法了解样品体外细胞毒性。吉姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色,胞浆染成粉红色,在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。细胞染色情况根据倒置显微镜下观察的细胞状态进行评估,通常根据细胞的形态学、空泡、脱壁、溶解和膜完整性丧失等情形对细胞损伤情况进行评估。评分和判定标准按照国际ISO 10993-5-2009

目的利用体外细胞毒性试验-吉姆萨染色法了解样品体外细胞毒性。

基本步骤

MRC-5细胞接种至96孔版,维持培养24h,形成半汇合单层。然后按照ISO 10993-12进行浸提液制备与样品浸提液的系列浓度实验化合物接触。暴露24h后进行吉姆萨染色,倒置显微镜下观察各组细胞形态,按下表进行评分,并采集相应图像。

评价标准

定性评价的记分方法见表1

1 细胞毒性记分方法

分级

细胞反应

细胞形态定性描述

0

未见细胞损伤

1

轻微

<20%细胞损伤

2

轻度

<50%细胞损伤

3

中度

<70%细胞损伤

4

严重

>70%细胞损伤

 

实验结果中,细胞毒性形态学分级大于2即可考虑受试物具有细胞毒性效应。如果实验中发现阴性对照组细胞出现细胞毒性效应和/或阳性对照组细胞未出现毒性效应,可认为该次实验数据不可靠。

 


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