医疗器械

实验原理：

本方法参考GB/T 16886.5:2017/ISO 10993-5:2009《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》，通过确定在琼脂糖凝胶中扩散后的细胞毒性来评估潜在刺激性。该试验用于细胞毒性定性评价，该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的物质或与琼脂反应的物质。

目的：通过确定在琼脂糖凝胶中扩散后的细胞毒性来评估潜在刺激性。

基本步骤：

L929细胞接种至培养皿中，维持培养24h至细胞近汇合80%以上。显微镜检查培养细胞的近汇合和形态学情况。弃去培养皿中的培养基，然后将融化琼脂琼与培养基混合配制所需比例，吸取一定体积至皿中。中性红染色约15～30min后弃去。然后将实验样品的平行试样小心地放在皿的固化琼脂层上。暴露24h后倒置显微镜下观察各组细胞形态及褪色情况，按下表进行评分。

评判标准：

在去除样品前后进行观察，倒置显微镜下观察并记录细胞形态变化，细胞形态异常包括一般形态变化、空泡、脱壁、溶解和膜完整性丧失。按表1进行细胞形态定性观察分级。按表2进行反应区域结果评判。

表1. 细胞毒性形态学定性分级

评分和判定标准按照GB/T 16886.5:2017/ISO 10993-5:2009《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》，如果根据表1和表2的评分>2时，认为具有细胞毒性效应。

实验原理：

参考ISO 10993-5-2009(EN)《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》，利用体外细胞毒性试验-吉姆萨染色法了解样品体外细胞毒性。吉姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。细胞染色情况根据倒置显微镜下观察的细胞状态进行评估，通常根据细胞的形态学、空泡、脱壁、溶解和膜完整性丧失等情形对细胞损伤情况进行评估。评分和判定标准按照国际ISO 10993-5-2009。

目的：利用体外细胞毒性试验-吉姆萨染色法了解样品体外细胞毒性。

基本步骤：

MRC-5细胞接种至96孔版，维持培养24h，形成半汇合单层。然后按照ISO 10993-12进行浸提液制备与样品浸提液的系列浓度实验化合物接触。暴露24h后进行吉姆萨染色，倒置显微镜下观察各组细胞形态，按下表进行评分，并采集相应图像。

评价标准：

定性评价的记分方法见表1。

表1 细胞毒性记分方法

实验结果中，细胞毒性形态学分级大于2即可考虑受试物具有细胞毒性效应。如果实验中发现阴性对照组细胞出现细胞毒性效应和/或阳性对照组细胞未出现毒性效应，可认为该次实验数据不可靠。