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温和无刺激

温和无刺激

概要:温和无刺激
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化妆品功效测试-温和无刺激

一、牛眼测试

试验接受标准: 如果阳性对照给出的值落在IVIS 历史平均值的两个标准偏差范围内,则认为测试是可以接受的。阴性对照的浊度值和渗透性值应小于用阴性对照处理的牛角膜的浊度值和渗透性值的既定上限。当测试样品的预测结果是明确的时候,由至少三个角膜组成的单次测试便足以评价测试样品。但是,如果在第一次测试中出现临界值,应考虑进行第二次测试。如果两次测试的预测结果都不一致的情况下,考虑进行第三次测试。如果在第一次测试中,3个角膜的预测不一致,则第一次测试运行的结果被认为是临界值,例如以下情况:3 个角膜中有2个角膜的预测结果与3个角膜的平均值的预测结果不一致时,或3 个角膜中的1 个角膜的预测结果与3个角膜的平均值的预测结果不一致,并且,这一个角膜的IVIS结果高于55这个截止阈值10个IVIS单位。如果第二次测试结果与第一次测试结果一致,则直接给出最终结果。如果第二次测试结果与第一次测试结果不一致,则应进行第三次测试,以判定测试样品的刺激性分类。如果在任何一次测试中得到分类1的预测结果,则可以不需要再进行下一轮测试。

表1. 预测模型

  IVIS

GHS分类

眼刺激/腐蚀性分级

≤3

不分类

无刺激性

>3, ≤55

无法预测

无法预测

>55

分类1

腐蚀或严重刺激性

 

二、鸡胚测试

(一)HET-CAM测试:刺激评分法

试验接受标准:如果试验设定的阴性对照和阳性对照产生的反应结果正好分别在非刺激性和强刺激性的分类范围内,则认为试验结果是可接受的。历史对照研究表明,采用0.9%氯化钠作为阴性对照,IS的值是0.0。采用1% SDS和0.1 mol/L氢氧化钠作为阳性对照,IS值的范围在10到19之间。每组至少6只鸡胚,取受试物0.3 mL直接滴加于CAM表面,观察CAM反应情况,并记录作用5min内每种毒性效应出现的时间,精确到秒,包括出血、凝血和血管融解3种反应,并记录反应的程度。

表1. 刺激评分法结果评价

刺激评分IS

预测分类Prediction classification

IS<1

无刺激性Non-irritant (NI)

1≤IS<5

轻度刺激性Slightly irritant (SI)

5≤IS<9

中度刺激性Moderately irritant (MI)

IS≥10

强刺激性/腐蚀性Strong irritant/Corrosive (Co)

 

(二)HET-CAM测试:终点评分法

试验接受标准:如果试验设定的阴性对照和阳性对照产生的反应结果正好分别在非刺激性和强刺激性的分类范围内,则认为试验结果是可接受的。历史对照研究表明,采用0.9%氯化钠作为阴性对照,IS的值是0.0。采用1% SDS和0.1 mol/L氢氧化钠作为阳性对照,IS值的范围在10到19之间。每组至少6只鸡胚,取受试物0.3 mL直接滴加于CAM表面,观察CAM反应情况,作用3min后,用生理盐水轻轻冲洗去除受试物,并在冲洗后约30s内观察出血、凝血和血管融解3种反应及程度。如果观察表明全部6只鸡胚至少1种反应的评分为中度以上(总评分≥12),试验应重复一次。

表2. 终点评分法结果评价

刺激性分类

无/轻刺激性

中度刺激性

强刺激性/腐蚀性

终点评分

ES≤12

12<ES<16

ES≥16

 

 

(三)CMAVA测试

毒性效应包括出血、毛细血管充血和鬼影血管,根据表1进行严重程度的区分。

1.

评分

血管效应

代码

观察描述

0

正常

N(Normal)

观察不到反应,CAM正常

1

鬼影血管

G(Ghost Vessels)

血管白色无血流,管壁清晰

2

毛细血管充血

C(CapillaryInjectio)

充血,或CAM小血管血流增加

3

极轻微出血

MH(Minimal Hemorrhaging)

细小出血点覆盖环内区域不足25%

4

轻度出血

SL(Slight Hemorrhaging)

环内出血点覆盖面积25-50%

5

中度出血

Mod(Moderate Hemorrhaging)

环内大量出血点或小区域出血范围覆盖50-75%

6

严重出血

Sev(Severe Hemorrhaging)

环内出血点区域>75%;深色结痂可能形成。

若观察到任何的血管变化,则可认定血管反应为阳性。记录全部的阳性或阴性效应,用概率分析计算RC50,即导致50%的鸡胚显示阳性反应的被测物的浓度。判定如下:

RC50

潜在眼刺激性预测

> 3.0%

无刺激性

≥1.0%, ≤3.0%

无法预测

<1.0%

刺激性

 


三、皮肤模型测试

试验步骤:1、皮肤模型准备:将预温的维持培养液加入12孔培养板2 mL/孔,把皮肤模型转移至含有维持培养液的12孔板中,放入培养箱培养过夜。2、待测样品与MTT反应:加入MTT溶液和待测样品10 μL至12孔板,充分混匀,培养箱中孵育。3、加样:取测试样品(包括NC和PC),均匀涂抹皮肤模型表面,室温放置后,用DPBS 彻底冲洗样品至无残留,然后置于含新鲜维持培养液的孔中进行孵育。每组设置3个平行。4、将皮肤模型放入含MTT溶液的孔中,并放入培养箱培养。MTT反应结束后,用打孔器取下表皮组织,移至EP离心管中,每管加入盐酸异丙醇,充分混匀后室温避光放置过夜。每管取溶液于96孔板中,在570 nm处读取OD值。以盐酸异丙醇为空白对照。

表1. 皮肤刺激性分类

  平均组织相对活率(%

UN GHS分类

>50

No Category

≤50

Category 1/2

 

 

 

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